上個世紀90年代，人們就已經(jīng)開始利用DNA免疫技術開發(fā)新型疫苗。DNA疫苗的基本原理：肌肉注射人工合成包含有病毒DNA的質粒載體，質粒在體內進行基因表達并合成對應的蛋白抗原，從而引起機體的免疫反應。這種疫苗最顯著的特點是通過內源抗原提呈途徑刺激T細胞產(chǎn)生免疫應答。然而，在實際應用中，基于該原理開發(fā)的DNA疫苗卻遇到了問題，例如如何選擇合適的免疫途徑和免疫佐劑。早期臨床研究數(shù)據(jù)表明，通過DNA疫苗免疫的患者血清效價較低，表明該方法沒有很好的免疫效果。 

近期人們對DNA疫苗的改進主要在以下2個方面：（1）采用更加高效的免疫途徑—利用基因槍和電穿孔技術將DNA質粒導入到機體細胞內，免疫效果得到顯著提升。（2）混合免疫沖擊。首先用DNA質粒進行免疫，然后利用重組蛋白、滅活的病毒或者減毒活疫苗沖擊，這種方法比常規(guī)的免疫沖擊采用同種抗原的效果要好很多。總體而言，在小型動物進行基因免疫的效果要優(yōu)于大型動物。這一特點也預示著可以采用此方法開發(fā)高質量的小鼠單克隆抗體?？紤]到DNA免疫誘導這種應答的獨特優(yōu)勢，早期的研究主要集中在T細胞免疫應答上。很少有人關注DNA免疫誘導B細胞免疫應答的在實際應用中的價值。事實上，誘導B細胞產(chǎn)生免疫應答更加適合開發(fā)高質量的功能性的單克隆抗體。

Meredith Hazen, Sunil Bhakta等用DNA免疫開發(fā)了一個抗多次跨膜蛋白（multi-drug resistant protein 4，MRP4）的單克隆抗體，MPR4是12次跨膜蛋白, 與腫瘤的多藥耐藥性的產(chǎn)生有關。腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生對癌癥的治療是一個很大的挑戰(zhàn)。以下為單克隆抗體的檢測數(shù)據(jù)：

圖1 anti MRP4抗體的檢測結果

01插入抗原序列的設計及優(yōu)化

DNA疫苗是用哺乳動物表達載體構建的。表達載體的選擇與設計的免疫原插入序列對抗體的功能有非常重要的影響。經(jīng)典的抗體開發(fā)流程，往往需要表達重組蛋白。針對某些蛋白，特別是多次跨膜的GPCR蛋白和離子通道蛋白，全長表達非常困難，蛋白序列和結構的完整性對開發(fā)功能性抗體是非常關鍵的。無論是天然蛋白提取純化還是重組蛋白的表達純化，在操作處理過程中，蛋白的空間結構極有可能會發(fā)生改變。通過基因免疫產(chǎn)生的抗體能識別蛋白構象表位的概率要大很多。主要原因在于外源基因可以在體內直接表達合成具有天然構象的全長蛋白，從而引起對應的免疫應答。

DNA疫苗對于抗原序列的選擇有獨特的優(yōu)勢。大部分情況下，會選擇表達全長蛋白序列，特別是多次跨膜蛋白，都有非常好的效果。而針對胞內表達的蛋白，設計者如果想改變蛋白表達的定位，可以人為的設計不同的信號肽，將胞內蛋白通過不同的信號肽的作用變成分泌表達蛋白，這樣可以增強免疫效果。同樣，對于一次跨膜蛋白，我們可以設計只針對胞外區(qū)的抗原序列，這樣產(chǎn)生的抗體就是只識別胞外區(qū)的表位。開發(fā)針對細菌毒素的抗體，可以選擇設計細菌毒素的某個片段序列，而不是全長，從而避免動物免疫過程中出現(xiàn)意外情況。

DNA疫苗的另外一個優(yōu)勢就是可以用相同的載體質粒構建過表達細胞株作為單克隆抗體的篩選材料，從而省略了蛋白表達純化的步驟。根據(jù)不同蛋白的宿主來源，可以選擇不同的篩選策略，詳情見表2。基于過表達細胞株的篩選方法已經(jīng)被應用于開發(fā)抗跨膜蛋白、病毒衣殼蛋白和胞內蛋白的單克隆抗體篩選中。在上述案例中，可以采用FACS，全細胞elisa或者IHC篩選替代傳統(tǒng)的重組蛋白間接elisa篩選。還有的研究人員采用一種新型的in-cell Western的方法篩選針對胞內表達、膜表達或者核表達的蛋白抗體。

表1：開發(fā)單克隆抗體中使用的DNA疫苗的抗原序列來源

 表2：單克隆抗體的篩選方法

02表達載體的選擇

DNA疫苗載體的啟動子序列是非常關鍵的調控元件。有研究通過比較CMV和human ubiquitin C promoter兩種啟動子對于免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動子都能最終獲得具有生物反應活性的高特異性的單克隆抗體，但是human ubiquitin C promoter這個啟動子只需要一次尾靜脈注射免疫就能使小鼠在七周之內維持非常高的血清效價。相對于常用的CMV啟動子，還有一種高效的哺乳動物細胞表達的啟動子--CAG(CMV/actin/Globin)，也能顯著的增強免疫效果。

03表達載體的選擇

免疫方法大致分為2類：第一種方法是將人工合成DNA質粒進行注射免疫，在注射緩沖液中通過加入脂質體或者納米粒子可以增強免疫效果。第二種方法是基于物理外力作用的基因槍技術和電穿孔技術?；驑尲夹g是將DNA質粒跟金納米粒子結合在一起后，再借助高壓氣流將納米粒子高速射入組織細胞內部。電穿孔技術首先是將DNA疫苗注射進入體內，然后在注射位置施加電流?？傮w而言，基因槍和電穿孔的免疫方法比注射免疫的方法引起動物產(chǎn)生免疫反應的效果要好很多，同時更加節(jié)省實驗材料。另外還有尾靜脈注射免疫和脾臟免疫，均能誘導動物產(chǎn)生對應的抗體。免疫時間間隔一般1周免疫一次，第四次免疫之后就可以檢測血清免疫效果。具體免疫方法和蛋白結構分類如下表：

 圖2：小鼠尾靜脈注射免疫操作流程

‍04免疫佐劑‍

在最開始研究人類DNA疫苗的時候，由于免疫效果較差，人們開始尋找合適的免疫佐劑以增強免疫效果。有文獻報道，腸桿菌伴侶蛋白Escherichia coli chaperone protein (GroEL) 被證實可以作為一種DNA免疫的分子佐劑。在開發(fā)針對GPCR的抗體過程中可以增強免疫應答。FLT3(fetal liver tyrosine kinase 3 ligand)和GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)也可以作為一種免疫佐劑，在增強免疫效果的同時，還能誘導產(chǎn)生識別天然蛋白的胞外區(qū)序列的抗體。

有一種DNA免疫-蛋白沖擊的混合免疫方法，可以誘導產(chǎn)生高效價和高親和力抗體。這種方法前面采用常規(guī)的DNA免疫，最后一次免疫沖擊采用重組蛋白，多肽或者滅活的病毒疫苗。

傳統(tǒng)的雜交瘤細胞融合開發(fā)抗體的方法在取脾臟融合之前需要進行免疫沖擊，以獲得有足夠多的能產(chǎn)生目的抗體的B細胞?；蛎庖叩姆绞揭餐瑯有枰M行沖擊，一般采用靜脈注射或者腹腔注射的方法，在融合之前的3-5天進行。有研究表明，如果采用DNA免疫的方法在細胞融合之前沒有進行沖擊，總體的融合率，抗體的親和力都會比較低，同時大部分得到的抗體都是IgM的亞型。

DNA免疫開發(fā)高質量的單克隆抗體有著以下獨特的優(yōu)勢：

（1）可以高效地測試不同的抗原序列的免疫效果；

（2）不需要表達或者純化抗原。特別是針對某些致病類抗原，從而避免了生物安全性的問題。

（3）針對某些突發(fā)的傳染性疾病，一旦基因序列被確認，就可以快速開發(fā)對應的抗體。

（4）可以開發(fā)針對構象表位的抗體；

（5）可選擇的免疫宿主廣泛，包括小鼠、兔子和人。